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PASO 1
Esta herramienta se puede utilizar en un LIMS o de forma independiente. En el modo independiente, debe arrastrar/soltar su espectro experimental como un archivo de texto delimitado por tabulaciones o copiarlo y pegarlo (CTRL-V) mientras mueve el mouse sobre la zona de colocación. La lista de espectros disponibles se mostrará en la tabla y simplemente puede hacer clic en el que desea mostrar.
PASO 2 (automático)
Una vez que se carga el espectro experimental, apm2s activa automáticamente la selección de picos y genera una lista de centroides monoisotópicos experimentales. Para el ajuste fino de los cálculos de simililaridad, se utilizan para ajustar el ancho de pico la evolución de la resolución en función de m/z (la cual depende de cada tipo de analizador de masas) y la curva de regresión correspondiente. Ambos cálculos se pueden ver en el Módulo de selección de picos. Los datos que se muestran a la izquierda representan la resolución (ancho de pico) versus m/z en nuestro Orbitrap Elite para el ejemplo de MS de azúcares disponible en la Lista de espectros experimentales.
PASO 3
Este paso es crítico para un buen resultado. Debes definir de la mejor manera posible todas las posibles piezas a grupos que pueden estar presentes en tu mezcla. Como en un puzle la solución viene dada cuando colocamos las piezas en el buen orden. Pensemos en el ejemplo de azúcares, que está disponible como ejemplo. Lo que puedes ver es que hemos separado el núcleo central (C42H63O28S7)0-1) que podrá estar o no estar. Este núcleo podrá tener asociado un numero entre 0-7 de cadenas laterales (C11H22)0-7 en las cuales hay unos sulfatos (SO3)0-7 que pueden perderse durante la ionización. En cada uno de estos sulfatos podremos contrarrestar la carga con H o Na (0-7) o una mezcla de ellos para tener una carga global entre -1 y -7. El programa generará todas estas posibilidades (muchas de ellas no tienen un sentido químico) e intentara encontrar sus correspondientes entre todos los picos experimentales. Se puede buscar en la esquina superior derecha en la ventana de “settings”, una lista de abreviaciones y típicos grupos funcionales que se pueden usar en aom2s. Último punto: especificar el método de ionización indicando los diferentes aductos y cargas. Puedes visitar nuestro glosario para más detalles.
PASO 4
El usuario podrá usar este filtro para definir los criterios deseados para las formulas moleculares buscadas como la carga, el rango de m/z o el nivel de insaturación. Esta opción no fue utilizada para los ejemplos experimentales que podrás cargar en la página.
PASO 5
Es importante ajustar esta sección, para mejorar la concordancia en la comparación experimental/teórica de los perfiles isotópicos. Lo primero de todo es introducir los límites en la intensidad relativa de tus datos experimentales (un valor típico puede variar entre 0.01-0.1). Después, deberemos ajustar el error (en ppm) límite autorizado en tu aparato (para nuestro Orbitrap, solemos autorizar alrededor de 5 ppm). Otro parámetro importante es la similaridad mínima (revisa el concepto de similaridad aquí). Para no tener un importante número de falsos positivos te recomendamos ajustar este parámetro en torno al 70-80%. Por último, debes decidir si la masa monoisotópica debe de estar presente en el espectro experimental y ajustar la zona de comparación la cual debe ajustarse dependiendo de la complejidad de la distribución isotópica.
PASO 6 (Opcional)
Una vez finalizado el cálculo, mixture da la opción de realizar un paso adicional de post-calibración para mejorar la precisión en masa y por tanto los resultados de similaridad y el número de especies encontradas. Para realizar este proceso de recalibración se necesita indicar el número de especies que se tendrán en cuenta y su porcentaje de similaridad en la ventana “Peak similarity parameters window”. Una vez definidos, se deberá de presionar el botón de calibrar y recalcular. Verás que mixture reprocesa los datos en unos segundos. Puedes ver el gráfico de errores (en Da y ppm) entre los valores encontrados y los valores esperados en el módulo “Peak picking and recalibration” en la parte superior. En el ejemplo puedes ver el gráfico de errores correspondientes a la mezcla de azúcares..
Resultados 1
La primera vista es una tabla de resumen denominada “List of fragments” que contiene toda la información sobre las moléculas identificadas. Puede ver la fórmula molecular y la forma de ionización, así como el pico monoisotópico de la fórmula molecular (sin ionización) y la masa monoisotópica final incluida la carga. Otros valores interesantes como el error en ppm, la abundancia relativa, la cantidad, el grupo y el puntaje de similitud también se incluyen en esta vista. Para cualquiera de los fragmentos, puede hacer zoom e interactuar en la vista de espectros de masas (Resultados 2). Todos los datos presentados en la tabla se pueden clasificar por cualquier criterio con un simple clic en el encabezado de la columna. También puede usar la barra de búsqueda para buscar más rápidamente un valor individual o usarlo por rango (ir al glosario). También puede exportar toda la tabla como archivo de texto con el botón Exportar datos.
Resultados 2
La ventana de espectros de masas muestra los datos experimentales (en rojo) superpuestos con los iones coincidentes teóricos (en azul). Los iones identificados se asignan y codifican en negro en la parte superior. Puede seleccionar un solo pico en “List of fragments” (Resultados 1) y se resaltará en esta vista (en amarillo). Es posible acercar (botón izquierdo), alejar (doble botón izquierdo) y mostrar esta ventana en la pantalla completa (barra de opciones en la parte superior de la ventana). El contenido de esta ventana se puede imprimir o exportar como archivo SVG (barra de opciones). El ejemplo de mezcla de azucares después de la recalibración se muestra en la figura (izquierda).
Resultados 3
La ventana de información muestra detalles para el ion seleccionado en “List of fragments”, como su nombre, masa monoisotópica, composición de grupos variables, carga y aducto de ionización. También encontrará la masa monoisotópica teórica y los datos experimentales m/z más cercanos. Debajo de esta ventana se muestra la cantidad asignada, el número de fragmentos distintos encontrados y su porcentaje de la intensidad total. También se muestra la cantidad total de fragmentos teóricamente posibles basados en las combinaciones seleccionadas.
La ventana de Similitud muestra la coincidencia del patrón isotópico teórico con el espectro experimental para el fragmento seleccionado con diferencias en la intensidad de los isotopólogos resaltados en amarillo. Puedes consultar nuestro concepto de similitud aquí.
