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PASO 1
Esta herramienta se puede utilizar en un LIMS o de forma independiente. En el modo independiente, debe arrastrar/soltar su espectro experimental como un archivo de texto delimitado por tabulaciones o copiarlo y pegarlo (CTRL-V) mientras mueve el mouse sobre la zona de colocación. La lista de espectros disponibles se mostrará en la tabla y simplemente puede hacer clic en el que desea mostrar.
PASO 2 (automático)
Una vez que se carga el espectro experimental, Aom2s activa automáticamente la selección de picos y genera una lista de centroides monoisotópicos experimentales. Para el ajuste fino de los cálculos de simililaridad, se utilizan para ajustar el ancho de pico la evolución de la resolución en función de m/z (la cual depende de cada tipo de analizador de masas) y la curva de regresión correspondiente. Ambos cálculos se pueden ver en el Módulo de selección de picos. Los datos que se muestran a la izquierda representan la resolución (ancho de pico) versus m/z en nuestro Orbitrap Elite para el ejemplo de MS/MS de ARN de Inosine, disponible en la Lista de espectros experimentales.
PASO 3
Para el siguiente paso, debes verificar el selector de aom2s y definir algunas características de tu nucleótido como su tipo, secuencia o cualquier modificación en corchetes. Se puede buscar en la esquina superior derecha en la ventana de “settings”, una lista de abreviaciones y típicos grupos funcionales que se pueden usar en aom2s. Último punto: especificar el método de ionización indicando los diferentes aductos y cargas. Puedes visitar nuestro glosario para mas detalles.
PASO 4
Se puede definir también cualquier otra modificación (como metales, pequeñas moléculas, aductos…) con una posición desconocida en la sección de grupos variables, separados siempre por una coma. Debes introducir una coma después del último grupo si quieres que el programa busque también los iones sin esos grupos definidos aquí (imagina que después de la coma el grupo es ninguno). Aom2s generará formulas moleculares para todas las posibles combinaciones entre los fragmentos seleccionados de la secuencia definida con los grupos variables definidos en esta sección. Esta opción fué utilizada para el ejemplo de aminoC6-DNA, donde el grupo C8H14N2O fué añadido seguido de una coma para buscar con/sin el grupo.
PASO 5
El usuario podrá usar este filtro para definir los criterios deseados para las formulas moleculares buscadas como la carga, el rango de m/z o el nivel de insaturación. Esta opción no fue utilizada para los ejemplos experimentales que podrás cargar en la página.
PASO 6
Es importante ajustar esta sección, para mejorar la concordancia en la comparación experimental/teórica de los perfiles isotópicos. Lo primero de todo es introducir los límites en la intensidad relativa de tus datos experimentales (un valor típico puede variar entre 0.01-0.1). Después, deberemos ajustar el error (en ppm) límite autorizado en tu aparato (para nuestro Orbitrap, solemos autorizar alrededor de 5 ppm). Otro parámetro importante es la similaridad mínima (revisa el concepto de similaridad aquí). Para no tener un importante número de falsos positivos te recomendamos ajustar este parámetro en torno al 70-80%. Por último, debes decidir si la masa monoisotópica debe de estar presente en el espectro experimental y ajustar la zona de comparación la cual debe ajustarse dependiendo de la complejidad de la distribución isotópica.
PASO 7
Antes de empezar el cálculo automático de Aom2s, debemos de seleccionar cualquiera de los ocho tipos de fragmentación a lo largo de la cadena fosfodiester. Aom2s también permite calcular otro tipo fragmentaciones clásicas como [a-B], perdida de agua, perdida de CH2 o perdida de multiples bases. Aom2s calcula también todos las combinaciones de fragmentación internas. La nomenclatura de las fragmentaciones esta definida por McLuckey aqui. Gabelica et al. escribió una magnifica revision de fragmentaciones en oligonucleótidos aqui. Empieza el cálculo tocando «calculate».
PASO 8 (Opcional)
Una vez finalizado el cálculo, Aom2s da la opción de realizar un paso adicional de post-calibración para mejorar la precisión en masa y por tanto los resultados de similaridad y el número de especies encontradas. Para realizar este proceso de recalibración se necesita indicar el número de especies que se tendrán en cuenta y su porcentaje de similaridad en la ventana “Peak similarity parameters window”. Una vez definidos, se deberá de presionar el botón de calibrar y recalcular. Verás que apm2s reprocesa los datos en unos segundos. Puedes ver el gráfico de errores (en Da y ppm) entre los valores encontrados y los valores esperados en el módulo “Peak picking and recalibration” en la parte superior. En el ejemplo puedes ver el gráfico de errores correspondientes a la molécula aminoC6-DNA..
Opcional
Aom2s puede calcular todos los fragmentos teóricos de cualquier secuencia de ADN/ARN. Para ello, comienza el procedimiento en el paso 3, seleccionando Aom2s y definiendo el tipo de ionización y la secuencia. Si lo deseas, podrás definir cualquier grupo variable (paso 4) o definir filtros para tus resultados teóricos (paso 5). Por último, selecciona cualquier fragmentación (paso 7) y dale a “calculate”.
Resultados 1
La primera vista es una tabla de resumen denominada “List of fragments” que contiene toda la información sobre las moléculas identificadas. Puede ver la fórmula molecular y la forma de ionización, así como el pico monoisotópico de la fórmula molecular (sin ionización) y la masa monoisotópica final incluida la carga. Otros valores interesantes como el error en ppm, la abundancia relativa, la cantidad, el grupo y el puntaje de similitud también se incluyen en esta vista. Para cualquiera de los fragmentos, puede hacer zoom e interactuar en la vista de espectros de masas (Resultados 2). Todos los datos presentados en la tabla se pueden clasificar por cualquier criterio con un simple clic en el encabezado de la columna. También puede usar la barra de búsqueda para buscar más rápidamente un valor individual o usarlo por rango (ir al glosario). También puede exportar toda la tabla como archivo de texto con el botón Exportar datos.
Resultados 2
La ventana de espectros de masas muestra los datos experimentales (en rojo) superpuestos con los iones coincidentes teóricos (en azul). Los iones identificados se asignan y codifican en negro en la parte superior. Puede seleccionar un solo pico en “List of fragments” (Resultados 1) y se resaltará en esta vista (en amarillo). Es posible acercar (botón izquierdo), alejar (doble botón izquierdo) y mostrar esta ventana en la pantalla completa (barra de opciones en la parte superior de la ventana). El contenido de esta ventana se puede imprimir o exportar como archivo SVG (barra de opciones). El ejemplo de mezcla de azucares después de la recalibración se muestra en la figura (izquierda).
Resultados 3
La ventana de información muestra detalles para el ion seleccionado en “List of fragments”, como su nombre, masa monoisotópica, composición de grupos variables, carga y aducto de ionización. También encontrará la masa monoisotópica teórica y los datos experimentales m/z más cercanos. Debajo de esta ventana se muestra la cantidad asignada, el número de fragmentos distintos encontrados y su porcentaje de la intensidad total. También se muestra la cantidad total de fragmentos teóricamente posibles basados en las combinaciones seleccionadas.
Resultados 4
La ventana de Similitud muestra la coincidencia del patrón isotópico teórico con el espectro experimental para el fragmento seleccionado con diferencias en la intensidad de los isotopólogos resaltados en amarillo. Puedes consultar nuestro concepto de similitud aquí.
Resultados 5
La ventana gráfica se puede consultar en el modulo «Report». En este módulo encontrarás la misma tabla de fragmentos que se ha calculado anteriormente. Puedes seleccionar/deseleccionar cualquier fragmento que se incluirá en la vista gráfica. En el ejemplo, se puede ver la vista gráfica de inosine-RNA con todos los fragmentos superiores al 90% de similaridad.
